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建立跳躍子突變庫來篩選造成BRAF抑制劑抗藥性之基因

為了解決756 Cargo tracking的問題，作者洪楨邦 這樣論述：

在相對應的跳躍酶協助下，跳躍子有兩種主要的特徵，一是擁有簡單插入DNA的機轉，二是有承載很大段DNA序列於跳躍子內的能力. 飛蛾跳躍系統在哺乳類細胞中相當有活性，因此對於基因交付，與藉由插入性突變而來的基因發掘，皆是很有用的工具。為了改善跳躍效率，前人努力地嘗試增進跳躍酶的活性。而我們藉由將核仁優先的訊號胜肽，接在經哺乳類密碼子優化過的飛蛾跳躍酶，製造了一種核仁優先型的飛蛾跳躍酶，可以在胚胎幹細胞與癌細胞中，增進跳躍的效率約三倍。這種跳躍酶的主要分布在核仁上。其所協助的插入點位，則如同原本的飛蛾跳躍酶一般，散布於整個基因體之中，此特色適合拿來作基因發掘之用。BRAF突變是黑色素瘤最主要的驅動

突變，BRAF抑製劑已被證明對攜帶BRAF V600E突變的晚期黑色素瘤有效。但是，大多數患者的腫瘤最終還是產生了抗藥性。為了尋找逆轉抗藥性的關鍵，高通量篩選是很有價值的實驗方法。在這個CRISPR-Cas9的時代，可藉由破壞基因而有效地作一失去活性的篩選，另外，增加活性的篩選則可以由帶有活化子的CRISPR-Cas9系統及病毒cDNA庫所執行。這些是屬於反向型基因篩選的方式，需要一些既有的知識去設計sgRNA、cDNA病毒，或是RNA干擾，才能去鎖定特定基因，因此，很難保證這類篩選的全面性與表達的平等性。我們提出另一種篩選方式，以增加活性的跳躍子製作突變庫，成為一種正向基因篩選的方法，來篩選

BRAF抑制劑的抗藥基因，我們使用對BRAF抑制劑敏感的SK-MEL-28黑色素瘤細胞株，來建立跳躍子突變庫，建立後用BRAF抑製劑vemurafenib與encorafenib各別篩選後，直到對照組的敏感細胞已無明顯細胞集落，而篩選後仍發現突變庫有抗藥性細胞集落存活，接著對原始突變庫與篩選後存活的細胞作架設型聚合酶連鎖反應(splinkerette PCR)並做次世代定序。由於發現encorafenib的篩選比vemurafenib更完整，因此主要選擇encorafenib篩選組的結果做驗證，經由方向性導向的KC-RBM研究方式來分析常見插入點的位置，我們發現存活細胞的跳躍子插入點，特別集中

於MITF, USP47, MAP3K4等候選基因的位置。為了驗證候選基因的重要性，我們經過6個月的BRAF抑制劑處理，建立了黑色素瘤SK-MEL-28與A375的抗藥株，兩者皆發現MAP3K4蛋白量的上升，RNA-Seq合併GSEA分析，發現JNK訊息路徑在抗藥的情況下是被激活的。西方點墨法實驗在抗藥細胞發現了JNK與p38的活化。而MAP3K4是JNK與p38的已知共同調控者，我們進一步在原本帶有敏感性的黑色素瘤細胞中高表達MAP3K4，結果細胞的抗藥性明顯增加。反之，在抗藥細胞中，以RNA干擾技術抑制MAP3K4的表達則可以減少抗藥性，這個抗藥性的減少，主要是因為細胞凋亡的增加。另外，在

原本敏感的黑色素瘤細胞中去抑制MAP3K4的表現，則對藥物敏感性與細胞凋亡沒有太大的影響。這些結果顯示BRAF抑制劑的抗藥性是複雜的，而MAP3K4與JNK及p38訊息路徑的協同，在抗藥性中是重要的，因此是一個有潛力去反轉BRAF抑制劑抗藥性的標靶。

多精胺酸胜肽作為牛樟芝基因轉型媒介之研究

為了解決756 Cargo tracking的問題，作者吳俊德 這樣論述：

牛樟芝為台灣特有種真菌，過去研究發現其富含一些具有藥理活性的化合物，具抗癌、醒酒與免疫調節等功用，隨著對這些成份深入研究，建立一套牛樟芝基因轉型系統顯得很重要。本實驗首先研究牛樟芝原生質體最佳化的製備方法，觀察各種可能影響原生質體消化產率的因素，例如菌絲培養時間、消化液酸鹼值與滲透壓穩定劑等，其次在原生質體再生方面，探討各種條件對原生質體再生的影響，包含不同培養基與滲透壓等，另外，本實驗發現到酸鹼值可能為牛樟芝原生質體再生的重要因素，並提供了一套牛樟芝原生質體再生系統。在完成牛樟芝原生質體的製備與再生實驗後，繼續探討真菌的基因轉型，目前所有的真菌基因轉型實驗中，都可發現各自的缺點，例如高細胞

毒性、轉型效率差與儀器門檻高等，根據過去的研究顯示，多精氨酸胜肽具有穿透細胞膜的特性，與低細胞毒性與高轉染效率等優點，廣泛的應用於動物細胞轉染實驗。本實驗依據這些特點應用在絲狀真菌上，首次以多精氨酸胜肽形成的複合物對真菌原生質體與菌絲進行基因轉型，成功的以複合物形式進入真菌原生質體與菌絲並表達目標基因性狀的紅色螢光；然而，結果顯示轉型後的菌絲無法生長在含抗生素的培養基中，轉型後的原生質體雖然可以使用具抗生素壓力的培養基篩選，但其菌株的菌絲抽取DNA後，跑PCR卻無法得到目標band，期待未來能進一步釐清此問題，從而建立一套快速且具有低毒性與高轉型效率的真菌基因轉型方法。